بعنوان :- استخالص المضادات الحيوية من البكتيريا الخيطية أعداد الطالب تحت أشراف الدكتور :- د.عبدالهادي البصير العام الدراسي

Transcript

1 وزارة التعليم العالي والبحث العلمي /جامعة سبها /كلية العلوم بحث مقدم الستكمال متطلبات درجة البكالوريوس في مجال علم النبات / شعبة االحياء الدقيقة بعنوان :- أعداد الطالب استخالص المضادات الحيوية من البكتيريا الخيطية تحت أشراف الدكتور :- عبدهللا مفتاح محمد حسين عبد المنان حسين د.عبدالهادي البصير العام الدراسي

2 بسم اهلل الرمحن الرحيم و م ا أ وت يت م م ن ال ع ل م إ ا ل ق ل يل صدق اهلل العظيم سورة اإلسراء اآلية ( 85)

3 اإلهداء الحمد هلل وحده ال شريك له الملك وله الحمد وهو على كل شيء قدير. بداية نهدي عملنا لمنارة العلم والعالمين األمي الذي علم المتعلمين إلى من نرجو شفاعته يوم الحشر الموعود الى خاتم االنبياء والمرسلين. سيدنا محمد صلى هللا عليه وسلم إلى من كلت أنامله ليقدم لنا لحظة السعادة.. إلى من كلله هللا بالهيبة والوقار.. إلى من ألهمني وعلمني العطاء بدون انتظار.. إلى من أحمل اسمه بكل افتخار.. آبائنا األعزاء الى صاحبة أطهر قلب.. إلى الحضن الذي ضمنا ونحن صغار وسهر الليالي في سقمنا وسقانا من عطفه.. إلى القلب الذي يراقبنا وخطى معنا الحياة خطوة بخطوة.. إلى من كان دعائها من أقوى أسباب توفيقنا. أمهاتنا الحبيبات إلى من بهم أكبر وعليهم أعتمد.. إلى شمعة منفذة تنير ظلمة حياتي.. إلى من بوجودهم أكسب قوة ومحبة ال حدود لها.. إلى من عرفت معهم معنى الحياة. إخوتنا وأخواتنا األحباء إلى من قضينا معهم أجمل ذكرياتنا.. إلى من نقشنا معهم على جدران الزمن أحلى أيامنا وأطيب أوقاتنا. أصدق ائنا األعزاء معدوا البحث

4 كلمة شكر وتقدير الحمد هلل رب العالمين نشكره ونحمده ونرجو ان يتقبل منا هذا العمل خالصا آملين أن ينفع هللا بالدنا وجميع الباحثين والمهتمين في هذا المجال. لوجهه الكريم واآلن ونحن نخطو خطواتنا االخيرة في الحياة الجامعية لن ننسى ان ننتقي أجمل العبارات ونصفها لنعبر عن شكرنا وامتناننا إلى الذين مهدوا لنا طريق العلم والمعرفة. أساتذتنا األفاضل أعضاء هيئة التدريس بقسم علم النبات كما نشكر كل من أخذ من وقته ليناقشنا في بحثنا هذا وهنا مرة أخرى تتبعثر الحروف وتخجل الكلمات ونحن نحاول أن نخطها في سطور بسيطة لنتوجه بالشكر الجزيل والعرفان لمن وقف على المنابر و أعطى من حصيلة فكره لينير دربنا. الدكتور : عبداهلادي علي البصري الذي تفضل باإلشراف على هذا البحث فله منا كل التقدير و االحترام. كما نخص بالشكر ل األستاذة : مسعودة عمر خليفة على عطائها الوافر ومجهوداتها في سبيل إنجاح هذا العمل وال ننسى أن نشكر كل من زرعوا التفاؤل في نفوسنا وقاموا ولو بجزء بسيط لمساعدتنا في إنجاز هذا البحث. معدوا البحث

5 فهرس احملتويات م الموضوع اآلية القرآنية... اإلهداء... كلمة الشكر... المقدمة... الكائنات المجهرية والمضادات الحيوية... مقاومة البكتيريات للمضاد الحيوي... الصفات الواجب توافرها في المضادات الحيوية... الهدف من البحث... المواد وطرق العمل... عينات الدراسة... أوساط النمو... تجهز اللقاح... استخالص المضاد... اختبار تأثير المستخلص... النتائج والمناقشة... شكل المستخلص رقم )1(... شكل المستخلص رقم )2(... شكل المستخلص رقم )3(... شكل المستخلص رقم )4(... شكل المستخلص رقم )5(... التوصيات... الم ارجع... الصفحة

6 18 المقدمة بدأت محاو لت اإلنتاج التخمري للمضادات الحيوية في أوائل األربعينات من القرن الماضي, وذلك بإنتاج البنسلين, حيث يعد البنسلين من أول المضادات الحيوية من حيث ا لكتشاف وا لنتاج, ومنذ ذلك الزمن تطورت تكنولوجيا التخمرات بشكل كبير ونتيجة لهذا التطوير تزايد اإلنتاج في بلد واحد كالو ليات المتحدة األمريكية من 1,8 كجم من البنسلين عام 1943 إلى حوالي 10 ألف طن عام 1982 )حداد و آخرون, 1992 عبد الحافظ و آخرون, 1996(. اعتمد اإلنسان منذ القدم على طرق عديده للعلج البدائي, حيث استخدم المواد بشكلها الخام مثل المواد النباتية أو الحيوانية والتي يكون لها تأثير على األحياء المجهرية الممرضة, فقد استخدم ا لغريقيون )الراتنجينات( النباتية وأملح معدنية مختلفة لعلج بعض األمراض الشائعة, بينما استخدم الصينيون فول الصويا لعلج البثور والدمامل وغيرها من اإلصابات )1996 Taiaro,.(Talaro and اشتق مصطلح مضاد الحيوي )Antibiotic( من مصطلح التضاد الحيوي Antibiosis والذي يقصد به ضد الحياة وذلك )بالنسبة للكائنات الحية الدقيقة الممرضة(, ويعتبر العالم األميركي Selman Waxman هو أول من أطلق عليه هذه التسمية, اكتشف الكسندر فليمينج )1928 Alexander Fleming م( أن أحد أطباق بكتيريا Staphylococcus aureus قد تلوثت بنمو فطري والذي ع ر ف لحقا بفطر Penicillium nutatum المنتج للمضاد الحيوي البنسيلين )Penicillin) والذي

7 و ج د بأنه فعال ضد البكتيريا الموجبة لصبغة جرام. نجح العالمين Ernst Chain "عالم كيمياء" و Howard Florey "عالم األمراض" في استخلص هذا المضاد الحيوي بصورة نقية و حاز كل من فليمينج و تشين و فلوري على جائزة نوبل عام 1945 م )1982.)Arnold, في عام 1944 م استخلص المضاد الحيوي المعروف باسم streptomycin من بكتيريا التربة من جنس Streptomyces التي سماها العالم األميركي Selman Waksman ا لكتينومايسيتات )1967.)Waksman, هناك مضادات حيوية تم استخلصها من فطريات الجنس,Aspergillus كما تم اكتشاف نوع آخر من فطريات ال Penicillium وهو Penicillium chrysogenum والذي ينتج ال penicillin بكميات وفيرة مقارنة بالنوع.)Arnold, )1982.P nutatum ل حقا اكتشف بأن للمضادات الحيوية المستخلصة من الفطريات تأثيرات واسعة المدى على كل من البكتيريا و الفطريات. 1. الكائنات المجهرية والمضادات الحيوية:-.1 تنتشر اإلحياء المجهرية المنتجة للمضادات الحيوية بصورة واسعة في الطبيعة, حيث وجدت في التربة والماء وبقايا النباتات والحيوانات وتعتبر التربة المصدر الرئيسي لعزل الكثير منها لذلك اتجه الكثير من الباحثين الي التربة لغرض الحصول على السل لت من األحياء المجهرية منتجة للمضادات الحيوية الجديدة )الكسندر, 1982.)Egorov, 1985 برزت أدلة علمية على كفاءة ا لحياء العلجية في التأثير و التي شملت أنواع كثيرة من جنس العصيات وانواعا من البكتيريا األخرى )الخفاجي, 2008 شاهين و شاهين, 2008(.(, وكما سبق فإن مصطلح المضادات الحيوية )Antibiotics( استعمل أول مرة من قبل العالم Waksman سنة 1942 والذي عر ف المضادات الحيوية بأنها مواد أيضية تنتجها اإلحياء المجهرية تقوم بتثبيط نمو أحياء مجهرية أخرى و ل تؤثر على الكائنات الحية المنتجة لها )1967.)Waksman,

8 إن المضادات الحيوية هي نواتج أيض ثانوية Secondary metabolites من نواتج التمثيل الغذائي للميكروبات "ألن تمثيلها غير مرتبط بنمو الميكروبات" وتلعب الكائنات المجهرية دورا مميزا في أنتاج المضادات الحيوية, فأكثر من حوالي % 85 من المضادات تكونها الميكروبات, % 60 من هذه النسبة ينتج من األكتينوميستات, % 10 من البكتيريا, % 10 من الفطريات وتنتج النسبة الباقية من كائنات أخرى كالطحالب وا لوليات والنباتات الراقية )مبارك و آخرون, 2005(. هنالك أنواع من المضادات الحيوية تؤثر على بدائيات النواة كالبكتيريا و هنالك أنواع تؤثر على كائنات من حقيقيات النواة مثل الفطريات. 2. مقاومة البكتيريا للمضاد الحيوي:-.1 تعتمد مقاومة مزرعة بكتيرية ما او أي كائن دقيق آخر للفعل الضار للمضادات الحيوية على تكوين طفرات مقاومة لها أو الى حدوث ا لنتخاب الطبيعي لسللة طفرية مقاومة لهذه المضادات الحيوية ( Kelly, Gerrettson- Cornell and Balagurunathan, 1992 ;1981(. هناك ثلثة طرق اساسية يمكن للبكتيريا ان تقاوم بها الفعل السام للمضادات الحيوية وهى:- 1. انتاج البكتيريا لإلنزيمات التي توقف نشاط المضاد الحيوي مثل انزيمات بيتا لكتمازات β-lactamases التي توقف نشاط البنسيلينات و السيفالوسبورينات عن طريق تحطيمها أو تكسيرها لحلقة بيتا لكتام بالمضاد الحيوي. 2. يمكن للبكتيريا تخليق مركبات مستهدفة ل تؤثر عليها المادة السامة, مثل تطفر البروتين في الوحدة البنائية 30s من الرايبوسوم وهذا ينتج عنه مقاومة البكتيريات للستربتوميسين, كما أن اضافة مجموعة الميثايل للوحدات البنائية )23 S r )RNA يمكن ان تؤدي الى مقاومة البكتيريات للريثروميسين. 3. تغير نفاذية البكتيريا, وهذا يؤدى الي عدم وصول التركيز الفعال من المادة السامه داخل الخلية البكتيرية ومثال ذلك هو وجود تركيز من التتراسيكلينات اقل داخل البكتيريات المقاومة الحساسة لها )أبو الذهب, 1965(.

9 3. 1. الصفات الواجب توافرها في المضادات الحيوية:- إن المضادات خارجيا ( الحيوية مجموعة من المواد العلجية تستعمل داخليا,Chemotherapeutic agents )وايضا لذلك يجب أن يتوفر فيها كل مقومات المواد العلجية من الصفات التي يجب أو يستحسن توفرها بالمضاد: -1 واسع. المقدرة على القضاء على عدد كبير من ا لنواع الطفيلية أي لها مجال ميكروبي 2- أن ل يكون لها قدرة على انتخاب سل لت مقاومة لها من الطفيليات. 3- أن ل تحدث تأثيرات جانبية Side effects بجسم العائل مثل الحساسية أو التأثير على األعصاب أو تهيج الكلية أو القناة الهضمية. 4. يجب أن ل تقضي )تض ر( على الميكرو فلورا الطبيعية للعائل بمعنى آخر أن ل تؤثر تأثيرا مبيدا شامل على محتويات القناة الهضمية من الكائنات الحية الدقيقة النافعة مما يتسبب في إفساد التوازن الطبيعي لهذه الميكرو فلورا فيسمح لكثير من الكائنات الغير مرضية أو المرضية جزئيا والتي كانت الفلورا الطبيعية بجسم العائل تعمل على عدم تأقلمها. الجدير بالذكر أنه كلما كان المضاد الحيوي ذا مجال ميكروبي واسع كلما كانت له القدرة على القضاء على الميكرو فلورا الجسمية التي تعمل على تجهيز الفيتامينات اللزمة للجسم و يشترط عند استعمال مثل هذا المضاد الحيوي إعطاء العائل كميات كافيه من الفيتامينات وخاصة التابعة لمجموعة فيتامين ب والتي تقوم بتخليقها الفلورا الطبيعية بالقناة الهضمية )أبو الذهب, 1965 شاهين و شاهين, 2008(.

10 4. 1. الهدف من البحث:- عملية استخلص مضادات دراسة في عزلها تم بكتيرية من أجناس من حيوية سابقة.

11 المواد وطرق العمل.2 1. عينات الدراسة:-

12 م استخدم في هذه الدراسة خمسة عينات من بكتيريا األكتينوميستات تم عزلها في دراسة سابقه. هذه العينات تم عزلها من تربة حديقة كلية العلوم بجامعة سبها ومن اخرون ربيع ز لف شمال غرب مدينة سبها )بركة و منطقة رمال صحراء.) أوساط النمو:-.2 استخدم الوسط الغذائي حساء الجلسرول ومستخلص الخميرة )حداد واخرون 1992(, والذي يحتوي على جليسرول )5 مل(, مستخلص الخميرة )2 جم(, فوسفات ثنائي البوتاسيوم )1 جم( وماء مقطر )1000 مل(, وزع الوسط على دوارق صغيرة الحجم )50 مل( و بواقع خمسة دوارق, بعدها عقم الوسط في جهاز التعقيم )ا لوتكلف( على درجة 121ᵒ م و لمدة 15 دقيقة. 3. تجهيز اللقاح:-.2 أ عطيت البكتيريا المراد اختبار مقدرتها على إفراز مضادات حيوية األرقام )1, 2, 4 3, و 5( ثم ح قنت في أنابيب زجاجية معقمة bottle( )universal محتوية على المرق المغذي "NB" Nutrient broth وح ضنت على درجة حرارة 37 لمدة ليلة واحدة, في اليوم التالي بعد التأكد من نمو البكتيريا تم نقل وحقن ما مقداره ) ميكروليتر( من هذه البكتيريا باستخدام ماصات معقمة في الدوارق التي تحمل نفس الرقم والمحتوية على الوسط الغذائي المعقم )50 مل( Brain Heart Infusion قبل أن توضع في الحاضنة )37 م لمدة 72 ساعة(..)Gebhardt et al., 2002( استخالص المضاد:-

13 بعد مرور فترة التحضين المذكورة ف صلت الخليا البكتيرية عن السائل بإستخدام جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة وبسرعة 4000 دورة / دقيقة, العينات التي لم تترسب بشكل كامل فصلت خلياها المتبقية بالمرشحات سعة 0.45 مم المعقمة, ن قل السائل )Supernatant( الخالي من الخليا إلى دوارق زجاجية معقمة وأ ضيف إليها المذيب العضوي ايثايل اسيتايل acetate( )Ethyl بنسبة 1:1 لكل عينه لغرض استخلص المضاد الحيوي, ر جت العينات المختلطة بالمذيب بإستخدام جهاز الرج Shaker لمدة 30 دقيقة, ن قلت بعدها المستخلصات مع المذيب إلى دورق الفصل وتركت )12 ساعة( لغرض فصل طبقة المذيب المحتوية على المستخلص عن الماء والمكونات ا لخرى, بعدها ن قلت طبقة المذيب إلى أنابيب بلستيكية معقمة وح فظت في الثلجة, في اليوم التالي وضعت في دو لب الغازات وعلى درجة حرارة الغرفة لغرض تبخير جزء من المذيب. ( al., Gebhardt et.) اختبار تأثير المستخلص:-.2 لقحت البكتيريا المراد اختبار حساسيتها للمستخلص في أنابيب تحوي المرق الغذي NB وحضنت على درجة حرارة 37 م لمدة 24 ساعة تقريبا, في اليوم التالي نشر منها ما مقداره ميكروليتر على خمسة أطباق بتري تحمل أرقام المستخلصات من 1-5 والتي تحوي الوسط الغذائي,Brain Heart infusion باستخدام الملقط المعقم )بالكحول واللهب( غمست أقراص أوراق الترشيح المعقمة )0.5 مم( في المستخلصات وثبتت على األطباق قبل أن يتم تحضينها على درجة م 37 لمدة 48 ساعة. 2002( al.,.)gebhardt et النتائج واملناقشة

14 الجدول التالي )جدول 1( يوضح تأثير المستخلصات المختبرة على ا لنواع البكتيرية المختبرة, حيث اتضح ان هنالك تباين وتفاوت في تأثير المستخلص ما بين نوع و آخر. جدول 1: تأثير المستخلصات الخمسة على البكتريا المختبرة قطر التثبيط بالمليمتر املستخلصات البكترييا املختربة E. coli 6mm 11mm 10mm 6mm 1.4mm Staph 7mm 12mm 6mm 9mm 1.1mm Pseud 11mm 9mm 7mm 9mm 1.8mm Pro 8mm 11mm 10mm 13mm 1.5mm 1 -املستخلص رقم )1(:- حيث من الواضح كما في الجدول التأثير الفعال للمستخلص, حيث اثر بشكل كبير على sp. Pseudomonas و sp. Proteus وبدرجة قليلة على ال sp. Staphylococcus و E. coli شكل.)1(

15 الشكل رقم )1( 2 -املستخلص رقم )2(:- كما نلحظ ان هذا المستخلص اثر بشكل فعال بدرجة اكبر من المستخلص الذي سبقه, حيث نلحظ انه اثر بشكل شبه متساوي على جميع ا لنواع المختبرة, شكل )2(. الشكل رقم )2( 3 -املستخلص رقم )3(:- لهذا المستخلص نلحظ التفاوت في مدى درجة التغيير في مدى درجة التأثير بين ا لجناس المختبر اذ انه اثر بشكل كبير على.E coli و sp. Proteus وبدرجة اقل على ال sp. Staphylococcus و sp. Pseudomonas كما في شكل )3(

16 الشكل رقم )3( 4 -املستخلص رقم )4(:- جنس آلخر, حيث اثر بشكل كبير على تقريبا ال sp. Staphylococcus و اقل على.E coli كما في شكل رقم )4(. نلحظ مدى التأثير يتغير من sp. Proteus وبشكل متساو sp. Pseudomonas وبدرجة الشكل رقم )4(

17 5 -املستخلص رقم )5(:- نلحظ على أكبر تأثير تفاوت بكتيريا المستخلص هذا ا لجناس على Pseudomonas sp. Staphylococcus sp. شكل )5( على أقل وبدرجة المختبرة أقل وبدرجة Proteus sp. حيث و كان على التأثير بكتيريا. E. coli الشكل رقم )5( إن هذه الدراسة تحتاج إلجراء المزيد من التجارب مثل إختبار تحديد نوعية هذه المركبات )من المستخلصات( وذلك بإستخدام Thin layer chromatography كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ومحاولة تعريف المركبات المسئولة عن قتل أو تثبيط البكتيريا المختبرة, وقد يكون من المفيد في

18 تعريفها مقارنتها مع أقراص المضادات الحيوية التجارية وذلك بقصد التقريب من حيث التأثير وليس الجزم بأنها مشابهة لها, هذا باإلضافة على أن تعريف البكتيريا التي تفرز أو تنتج هذه المركبات سيسهم أيضا في توفير معلومات أكثر عن هذه المركبات. إن إعادة هذه التجربة وفي تحضيرات أكثر تركيز من تلك المستخدمة في هذه التجربة قد يعطي نتائج اكثر تأثيرا. التوصيات:- نوصي بتوفير بنك لحفظ العينات البكتيرية المعزولة في القسم والتي لم يتم تعريفها بالكامل والتي قد تكون ذات جدوى اقتصادية, كما نوصي بتوفير مولدات كهربائية للمحافظة على مثل هذه العز لت من التلف.

19 المراجع References أوال. المراجع العربية:- أبو الذهب مصطفى كمال )1965(. البكتريا, دار المعارف الطبعة ا لولى - القاهرة / مصر. -الخفاجي زهرة محمود العالي والبحث العلمي العراق )2008(. ا لحياء المجهرية جامعة بغداد, وزارة التعليم - الكسندر مارتن الكسندر )1982(. وايلي و أو لده نيويورك / أمريكا. ط 2. مقدمة في ميكربيولوجيا التربة, دار جون - حداد محمد أحمد المالحي عبد القادر عبدالرؤوف المعملية في علم الكائنات الدقيقة )1992(. و الحسن جادهللا. التدريبات - شاهين عمر و رند عمر شاهين )2008(. العربي- عمان / األردن. المضادات الحيوية, دار الفكر عبد الوهاب محمد و محمد الصاوي محمد مبارك )1996(. التطبيقية, المكتبة األكاديمية, 121 شارع التحرير- القاهرة / - عبد الحافظ الميكروبيولوجيا مصر. - مبارك محمد الصاوي محمد و عبد الوهاب محمد عبد الحافظ و راوية فتحي جمال )2005(. عالم البكتيريا مكتبة أوزوريس- القاهرة / مصر. - بركة عائشة صالح وعائشة محمد وردكو و حواء حسن شهاء )2015.)2016

20 -محمد عائشة بركة و حواء شهاء حسن و عائشة وردكو صالح )2016(. عزل البكتيريا المقاومة للمضادين الحيويين النستاتين و الستربتومايسين من التربة, بحث قدم للحصول على درجة البكالوريوس في علم النبات- جامعة سبها كلية العلوم- قسم علم النبات- سبها/ ليبيا

21 ثانيا. المراجع االجنبية:- - Arnold, R. M. (1982). Antibiotics. In; R. F. Doerge (ed.).wilson and Gisvolds,Text book of organic medical pharmaceutical. j. B Lippincott Co., U.S.A.P Balagurunathan, R. (1992). Antagonistic actinomycetes from Indian shallow sea sediments with reference to α, β unsaturated γ lactone type of antibiotic from Streptomyces griseobrunneus. Ph. D. Thesis, Annamalai University, India, pp Egorov, N. S. (1985). Antibiotics scientific approach. Mir publishers, Moscow. - Gerrettson- Cornell, L. and Kelly, J. (1981). Notes on the actinomycetes of a forest soil in new south wales 1. isolation and preliminary characterization. Forestry Commission of N.S.W. Sydney Australia. Judith. K., Schimana, J., Müller, J., Fiedler, H., Kallenborn, H. H., Holzenkämpfer, M., Krastel, P., Zeeck, A., Vater, J., Höltzel, A., Schmid, D. G., Rheinheimer, J. and Dettenr, K. (2002). screening for biologically active metabolites with endosymbiotic bacilli isolated from arthropods. FEMS Micro Lett 217,

22 -Talaro, K. and Talaro, A. (1996). Fundations in Microbiology, basic principles, Times mirror higher education group, WM. C. Brown publishers. Chicago. -Waksman, S. A. (1967). the actinomycetes:a summary of current knowledge.the Ronald press Co. New york. -Gebhardt, K.; Schimana, J.; Müller, J.; Fiedler, H.P.; -Kallenborn, H.G.; Holzenkmpfer, M.; Krastel, P.; Zeeck, A.; Vater, J.; Holtzel, A.; Schmid, D.G.; Rheinheimer, J.; Dettner, K. (2002) Screening for biologically active metabolites with endosymbiotic bacilli isolated from arthropods. FEMS Microbiol. Lett., 217: